熒光定量PCR儀相關對照問題的處理
1.陰性對照和陽性對照都出現陽性擴增帶
原因：
①陰性樣品和PCR反應試驗污染。
②電泳上樣時避免PCR產物漂移到其他孔而影響結果判定。
解決方法：
①更換全部試劑，必要時更換所有移液器。
②應小心操作，或瓊脂糖凝膠加厚，增加每孔的容量，可避免加樣液的溢出。
2.陽性對照呈陰性
原因：
①陽性樣品或加入陽性模板失效。無論是組織還是血清，凍融1次后病原數量明顯減少。
②加入試劑量不準確或遺忘了某一成分。
解決方法：
①將陽性對照樣品分成小包裝。每個包裝夠用1次好。
②仔細核對試驗記錄，校對移液器。
3.出現非特異擴增帶
原因：
①樣品模板量過多。
②引物或TaqDNA聚合酶多。
③鎂離子濃度過高或退火溫度過低。
解決方法：
依據熒光定量PCR儀具體實驗的情況，分析上述可能出現的原因，采取相應的措施。
4.陽性對照擴增帶弱
原因：
①電泳時瓊脂糖中EB含量少或長時間后再用已失效。
②擴增效率不高。
解決方法：
①是將瓊脂糖凝膠放入含有EB電泳液中再染30 min后再觀察。
②檢測儀器是否正常工作。
③增加純化DNA或cDNA樣品的稀釋倍數。
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